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四環凍干機—心臟瓣膜的凍干

更新時間:2023-08-10 點擊次數:516


心臟瓣膜的凍


ALAIN C進行了心臟瓣膜的凍干研究。ALAIN提出瓣膜凍干應具備三項功能:第一,應該能夠提供多孔結構,以便當使用瓣膜將其懸在介質中復水時,能允許纖維原細胞迅速進入瓣膜內部;第二,殺死異源細胞;第三,保持膠原質結構以保證瓣膜的機械強度。ALAIN的實驗研究中用的是豬的瓣膜,來自屠宰場。豬的平均年齡和重量分別是18周和80kg。心臟瓣膜是在豬死后2h以內從心臟上切下來的,瓣膜片在磷酸鹽緩沖液里洗滌三次。葉片在4℃下存儲超過24h。實驗中總共用到了76個葉片。



心臟瓣膜玻璃化溫度的測定

將質量為20~30mg的一塊瓣膜葉片密封在鋁制器皿中,使用裝配有液氮低溫附件的Perkin-Elmer DSC2儀器測量。以1.25K/min的速度冷卻到173K,在以40K/min的加熱速度過程中,記錄溫度,得到溫度-熱流圖如圖5-22所示。由圖中數據得出,玻璃化轉變溫度Tg-83℃。

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凍干工藝對凍干心臟瓣膜形狀的影響:

心臟瓣膜的凍干實驗是在一種實驗型快速凍干儀器中進行的,其結構如圖5-23所示。 

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將冷阱浸在硅樹脂油的冷浴中冷卻到-70℃,用旋片泵維持真空度,用麥氏計來測量真空度,可以達到0.005mmHg。

三個瓣膜葉片用一種單纖維尼龍絲系在一小塊PVC塑料網上,裝在一個Falcon塑料管中。大多數實驗中,Falcon塑料管浸在液氨或控制了溫度的硅樹脂油中,瓣膜葉片在冷空氣環境下冷凍。冷卻Falcon塑料管的冷浴的溫度為-15℃、-40℃、-80℃或者-196℃。然后,將Falcon塑料管從低溫液體中取出,快速地放入凍干機的凍干箱里;少數實驗中瓣膜葉片被直接浸入-60℃或者-80℃的酒精浴冷凍。樣品的凍結速率數據列于表5-13中。在葉片角落里粘有一個與圖表記錄器相連接0.12mm的銅鎳合金,用于測量溫度。凍干室初始溫度為室溫22℃,然后通過浸在-20℃或-30℃的恒溫浴里控制溫度。之后,自然升溫,此為非控制凍干。

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真空干燥連續進行3h,這時葉片溫度穩定在室溫(22℃)。通過SEM對這些葉片的部分進行檢查顯示出預期的多孔結構,如圖5-24所示??资怯衫鋬鲋行纬珊透稍镏序尦谋w產生的。而且有一個規律,冷卻速度越低孔越大[對比圖5-24(a)和(b)],但不連續,每個樣品也不一樣[如圖5-24(b)的例子]。葉片的厚度與冷卻速度有直接聯系。因為大多數孔的尺寸顯得比預期的要小得多,可以嘗試著在干燥前對葉片熔化和再冷凍,這樣可以提高冰孔的尺寸。其他更多的葉片以6℃/min的速度冷卻,在溫度為37℃的水浴里熔化,然后以相同的速度再冷凍,三個以上再以72℃/min的速度冷卻,但是它們產生了與僅僅經過一次冷凍的葉片相似的SEM外形。

另一個問題就是稠密層的出現,許多樣品表面很顯然沒有孔[見圖5-24(b)];SEM圖片顯示葉片表面是壓實的,內部孔和外部很少連通[見圖5-24(c)];在葉片物質內部同樣出現了緊湊層[見圖5-24(d)]。這些現象顯示了在干燥過程中發生了廣泛的坍塌,可能是在干燥過程中溫升較快造成的。在處理結束,葉片的含水量很少,很可能是發生了熔化和蒸發,而不是升華。因此后面進行了嚴格的控制冷凍干燥實驗。

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在控制冷凍干燥過程中,選擇了兩種冷凍方法:將Falcon試管放在-40℃的冷浴里(平均冷卻速度為6.7℃/min),或者是放在196℃的液氮里(平均冷卻速度為51℃/min)。將干燥燒瓶放在設定溫度的冷浴里6h,它的溫度就被控制在-20℃或-30℃;6h后關掉冷藏室,讓浴溫自動上升。測量的溫升速度是0.06~0.08℃/min,從-20℃達到0℃需要5h,從-30℃到達0℃需要6.3h??偟恼婵崭稍飼r間需要16h,最終溫度為5~11℃。每個實驗方案凍干了三個葉片,然后經過SEM檢驗。從8個瓣膜里得到的24個葉片都經過相同的處理,在干燥處理過程中或結束后和再水化后測量水的含量。結果顯示在-30℃時的干燥速度是很慢的,20℃時盡管在那個階段的最后將干燥時間從6h延長到12h可以保證水的含量很低,但是它對最后剩余水氣沒有影響。更多的研究是在為-20℃或-30℃溫度下干燥6h的初始干燥后,再以0.06℃/min的加熱速度進行第二次干燥,整個過程需要16h。

SEM照片(見圖5-25)顯示,-20℃干燥的葉片有更好的外觀,多孔基體更統一,沒有坍塌的區域和厚的、稠密的邊界層??椎某叨缺确强刂评鋬龈稍锏娜~片看上去大很多[比較圖5-24(a)和圖5-24(b)與圖5-25(a)和圖5-25(b)]。凍結速率為7℃/min的葉片孔顯得比50℃/min的葉片的孔稍大而且更均勻。-30℃干燥的葉片表面外殼更厚一些,顯示了在第二個干燥階段中已經發生了坍塌。這是由于在最初的溫度為-30℃干燥6h后,有更高的水含量。所以,起初干燥的溫度最好是-20℃。但是,在兩種情況下,表面都缺乏明顯的與內部多孔基體相連通的孔。

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為了確定從SEM檢查得到的壓痕數量,測量了凍干葉片的厚度和孔的尺寸。圖5-26顯示了對兩種冷卻速度的數據比較,一種是非控制快速干燥,另一種是-20℃的控制干燥。不考慮干燥方法的影響,快速冷凍后葉片變得更厚了;同樣,不考慮冷卻速度的影響,控制干燥的葉片也更厚了。假如避免了崩塌,對于兩種冷卻速度,沿著垂線方向從內流到外流表面的冰孔數量相似。對分別經過1℃/min、5℃/min、25℃/min冷卻速度的冷凍,然后進行初始干燥溫度為-20℃的冷凍干燥的葉片,通過SEM測量了其孔的截面積的分布。在兩個垂直方向上進行了表面觀察,第一個是半徑方向,即從容器表面指向容器中心;第二個所指的切線方向與第一個方向成90°,即它與容器表面的切線平

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行。結果如圖5-27所示??梢钥闯隼鋮s速度(1℃/min)低,凍干樣品冰孔尺度分布廣,而且在斷面的兩個方向上沒有顯著的差別;冷卻速度快則凍干樣品冰孔尺度分布窄,而且切線方向上比半徑方向上孔徑更大,也就是說,冰晶體形成于切線方向。經測量,在兩種冷卻速度下,大多數冰孔半徑方向上面積為100~350μm2,但是冷卻速度為5℃/min的比25℃/min孔徑稍長,樣本的橫斷面積分別為400μm2和200μm2。凍干工藝為:以5℃/min的冷卻速度,然后在-20℃真空干燥6h,接著在緩慢的加熱過程中進行二次干燥,得到的凍干多孔葉片殘余水分為8%~9%,內部孔的測量尺寸為100~350μm2。這對橫斷面積為150-200μm2的纖維原細胞提供了足夠的通道。因此,在后來的所有研究中都采用了上述葉片凍干工藝。

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SEM未能回答的問題:“內部冰孔與孔之間是互相連通,還是它們是獨立封閉的?"為了回答這個問題,干燥前對葉片涂上熒光素,然后再用甲基安息香酸鹽進行清洗后對它進行顯微鏡共焦掃描(CSM),結果顯示它的結構與開放的塑料泡沫相似。不過,SEM和CSM都暗示內部的多孔結構很少與表面聯通。圖5-28(a)和(b)顯示了SEM的外觀,流入表面上的凹陷很小(10~20μm),顯得與內部的多孔結構不連通。CSM同樣揭示了表面的口袋狀結構,盡管橫向連通的可能性不能被全部排除,但是它們似乎是封閉。

然而,當葉片被放置在玻璃皿上,大部分流人表面朝上,用1根8×20號手術針就可以創造出三角形的穿孔,直徑尺寸為75~100μm[見圖5-28(c)和(d)],穿透了流出表面,孔徑小于10μm。

ALAN的這項研究主要針對的是他提出的凍干瓣膜應具備的第一項功能:提供多孔結構,以便當使用瓣膜將其懸在介質中復水時,能允許纖維原細胞迅速進入瓣膜內部。

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